上一期我們介紹了 物質平衡試驗的目的、試驗的準備以及試驗的設計，這一期我將繼續介紹如何對我們在臨床操作中收集的樣品進行處理，如何進行分析、如何對結果進行評估等。

到現在為止，我們獲得了所有受試者的血樣、尿樣和糞便樣品，其中糞便樣品需要與水混合以1:2或1:3的比例進行  混合，制成勻漿。在血樣的樣本檢測之前，需要對樣本進行合并處理（pooled）。一般有三種合并方法：同一受試者合并，同一采樣點合并以及全部合并。第一種方法就是將同一受試者的全部采樣點合并在同一個樣本中，這樣可以獲得整個回收期間各藥物相關物質的占比等數據，也可以比較不同受試者之間的差異性。類似的第二種方法是在同一個采樣點或采樣周期，將所有受試者的樣本按同比例混合（即每受試者取一小份），這樣可以觀察每個時間點各藥物相關物質的變化情況，非常具有參考價值，但同時也是最耗費時間和儀器的。第三種方法是最省時間和成本的，是將所有受試者每個采樣點按比例混合并將所有采樣點合并獲得的。具體采用那種方法，得基于實際的數據需要和時間進度來決定。對于排泄物的合并處理，一般是在每個采樣周期，按同比例混合每個受試者的樣品。

人體物質平衡試驗需要我們回收一定的放射性活性，這一比例一般為90%（總放射性），或者連續兩個采樣周期回收的排泄物放射性小于1%。當然這個回收率并不是強制性要求，它意味著如果回收率在這之下，需要對試驗的設計操作以及分析過程進行一定的評估，最終應該得出一個可能的結論以說服監管機構對低回收率的接受。對放射性的檢測傳統上采用液體閃爍計數器（LSC）進行試驗過程中的實時檢測，確保我們回收了足夠的放射性。許多的物質平衡試驗都是通過LSC進行檢測，比如輝瑞的蘆卡帕利、諾華的卡馬替尼等。這一過程可能需要使用我們最開始準備藥品過程中獲得的DPM/ng，也就是每分鐘計數/ng的數值來進行計算。

代謝物譜的檢測一般是使用HPLC方法進行分離檢測的，分為離線和在線檢測兩種方法。離線檢測是通過HPLC對樣本進行分離，隨后收集不同時間產出的小份樣本，隨后可以使用串聯質譜，流式閃爍分析儀（FSA），加速器質譜（AMS）進行結構信息的或放射性信息的收集。而在線檢測則是HPLC和串聯質譜以及放射性分析儀器進行聯用，從HPLC分離的樣本通過分流器按比例進入兩種儀器同時進行檢測。在樣本分析的過程中，我們一般通過放射性計數而非峰面積計算物質的含量，這樣更加準確，并且不需要儀器針對每一種化合物的結構進行校正。選擇哪種放射性檢測方法主要與放射性活度有關。

禮來正在研發中的小分子BACE抑制劑LY3202626的物質平衡試驗中，由于其血漿放射性太弱（給藥劑量100μCi），所以采用了AMS方法幫助建立了其代謝物譜。其504h的排泄物收集時間僅僅獲得了75%的總回收率，提示LY3202626消除過程極其緩慢。其血漿放射性半衰期為32.5h，原型半衰期僅為24.5h，所以血漿中存在長半衰期的代謝物。同時，禮來認為，代謝物可能經由肝腸循環，通過腸道菌群去結合被重新吸收，從而大幅延長了半衰期。

對血樣的分析可以讓我們獲得許多信息，如循環的代謝物譜，循環中代謝物的含量與占比。我們需要重點關注的是不成比例的藥物代謝物。什么叫不成比例的藥物代謝物呢，根據FDA藥物代謝物安全性測試（Safety Testing of Drug Metabolites – Guidance for Industry）中的定義，不成比例的藥物代謝物指的是僅在人體內出現的代謝物或者在人體內的血漿濃度大于其在非臨床動物研究中動物體內的血漿濃度的代謝物。一般來說重點應該關注占總藥物相關暴露度10%以上（以穩態AUC計算）的不成比例的藥物代謝物。在樣本分析的過程中，如果我們發現某代謝物是不成比例的藥物代謝物，而且其還占總暴露度AUC的10%以上，我們就可能需要對其進行進一步的研究。分情況討論，如果代謝物是人類特有的，則必須開展額外的非臨床試驗，如果不是人類特有的但是血漿濃度已經大于前期開展的非臨床動物體內的濃度的話，也應該開展非臨床試驗以覆蓋代謝物的人體血漿濃度。如果前期非臨床試驗所測試的代謝物濃度范圍已經覆蓋了人體的血漿濃度，則無需開展更多的研究。需要注意的是，這個10%的界限應該根據代謝物本身的特性進行評估，比如對于酰基葡糖醛苷，由于其可以與生物大分子共價的結合，所以具備顯著的毒性，可以適當降低10%的界值。同時，這些非臨床研究必須在III期臨床試驗之前完成，這使得對物質平衡研究的時間選擇有一定的要求。

如果在血樣的分析中我們發現，原型藥物的半衰期比放射性半衰期短，這意味著循環中存在長放射性的代謝物，我們需要對其進行分析，是否具有藥理毒理活性。如果屬于不成比例的代謝物，還應該開展額外的非臨床研究。代謝物半衰期過長，會不會在多次給藥過程中產生蓄積，會不會產生藥理毒理作用，這些問題都必須在III期臨床試驗之前予以解決。

對血漿代謝物譜的識別應該結合已有的前期研究數據，比如前期的臨床PK研究，體外酶學及DDI研究等，有助于我們對代謝物譜的識別。對于主要的代謝物，如AUC占比超過25%或其活性占比超過10%的情況下，需要有相應的體外DDI數據進行支持，包括主要的I相代謝酶（P450等）。如果代謝物是直接II相代謝的產物，則考慮研究其與UGT酶家族（如UGT1A1和UGT2B7等）的相互作用。一般來說這些應該在臨床前的體外酶學和DDI研究中進行分析。

對排泄物樣本的分析主要回答如下幾個問題：有多少藥物從經由糞便排泄？有多少藥物經由腎臟途徑排泄？排泄物的代謝物譜如何？藥物的排泄途徑是啥？藥物的消除機理是啥？而這些問題會提升我們對藥物本身的理解，同時也會指導我們特殊人群的用藥。舉個例子，如果腎臟途徑是主要的排泄途徑，說明藥物吸收的程度高，尿液回收放射性的比值+血漿放射性比值與總放射性的比值，其實就代表了藥物吸收率（Fa）的下限值。為什么是下限值呢，因為糞便中的放射性不一定來源于吸收后的藥物，可能是沒有吸收的藥物，可能是在腸道內代謝形成的代謝物。這就是為什么推薦在進行口服人體物質平衡的試驗的同時增加靜注的物質平衡試驗。這樣可以直接計算出真實的藥物吸收率。特別是如果糞便中的原型藥物占比較高的情況下，建議開展絕對生物利用度研究的同時，可以考慮開展藥物在糞便中的穩定性，評估其是否可能在腸腔內被代謝。另外，對吸收率的評估也有助于BCS的生物豁免申請。ICH M9R2中對滲透性的定義，絕對生物利用度大于85%或者尿液中原型藥物回收率大于85%或尿液中原型+I相氧化代謝物+II相結合代謝物的總和回收率大于85%的情況下，可以被定義為高滲透性。

下面我們舉個例子以說明Fa對我們分析藥物消除機制的重要性：

上面這張圖片展示了某藥物的消除機制，可以看到原型藥物在糞便中占到了50%的放射性，在不知道Fa的情況下，這50%的放射性可能來自于兩個方面：1. 藥物口服后沒有完全吸收，直接隨著糞便排出體外；2. 藥物被吸收，但由通過膽汁排泄或腸壁分泌的方式排入腸腔內。我們假設通過絕對生物利用度試驗或者靜注的物質平衡試驗得到了Fa的值，當Fa=100%的時候，藥物完全被吸收，也就是說糞便中所有的原型藥物都是通過膽汁排泄或者腸壁分泌，這個時候需要注意是否有p-gp或BCRP的DDI。當Fa=50%，糞便中所有的原型藥物都是沒有被吸收的，所以其他的消除途徑變為主要的消除途徑，這個時候建議分析相應路徑的代謝酶和轉運體的DDI。

正如上面例子所示，藥物的排泄過程與轉運體息息相關，常見的與藥物相關的轉運體包括：p-糖蛋白（p-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、有機陰離子轉運多肽（OATP1B1/1B3）、有機陰離子轉運體（OAT1/3）、有機陽離子轉運體（OCT2）等。通過對排泄數據的分析，可以提供一定的提示來指導是否應該開展相應的轉運體的體外研究。參考FDA臨床藥物相互作用-細胞色素P450酶以及轉運體介導的藥物相互作用指南（Clinical Drug Interaction Studies-Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions – Guidance for Industry）：

• 如果有證據表明腸道吸收、膽汁排泄或者腎臟主動排泄對PK參數的變異性有顯著貢獻的情況下，應該考慮研究p-gp和BCRP介導的DDI。如果我們開展了口服和靜注的物質平衡研究，是可以得出腸壁分泌和膽汁排泄對原型藥物的排泄具有什么樣的影響，因為靜注情況下，只有這兩種方式可能會使得原型藥物出現在糞便中。所以，當我們發現這兩種方式對原型藥物的排泄具有顯著的作用，那么對p-gp和BCRP等腸壁常見外排蛋白的DDI研究就顯得十分必要。

• 又如有證據表明肝臟消除或膽汁排泄是藥物主要的消除途徑的話，并且藥物本身特性決定了其被動轉運程度小，肝臟組織有蓄積現象等情況，那么應該考慮有機陰離子轉運多肽（如OATP1B1/1B3）介導的DDI，因為OATP家族是肝細胞主動轉運藥物的主要轉運受體。

• 有證據表明藥物經過顯著的腎臟主動排泄過程（比如滲透性差或溶解性差卻具有比較高的尿液回收率，占到了全身清除率的25%以上），考慮有機陰離子轉運體（OAT1/3）以及多藥及毒性化合物外排轉運體（MATE）介導的DDI。這些轉運體都是將藥物從血液轉移至尿液的主要轉運體。

在開展體外DDI試驗之后，如果有必要可以考慮繼續開展體內DDI試驗，以研究這些相互作用在體內的重要性，應在III期臨床開展之前完成相應的研究。

最后闡述一下人體物質平衡研究開展的時機，目前各國并沒有指導原則或法律法規規定了此研究開展的時機，在去年12月，CDE發布了《創新藥臨床藥理學研究技術指導原則》，其中提到，物質平衡研究通常在確證性臨床前完成（III期臨床），建議在早期臨床中盡早開展相關研究。從另一個角度來說，物質平衡研究的結論對其他如DDI研究，長期致癌性試驗等需要在III期臨床之前或者與III期臨床同步開展的研究有重要的指導作用。所以一般來說，物質平衡試驗在初步判斷化合物具有有效性之后就可以開展了，比如Ib期或者IIa期。綜合考慮物質平衡試驗的成本因素，在獲得有效性數據之前開展風險較大。2021年是我國創新藥百花齊放的一年，CDE共收到創新藥申請1400余項，化藥800余個，其中絕大多數都應開展了人體物質平衡試驗。了解到物質平衡試驗的重要性，希望這篇文章可以給予大家對物質平衡試驗一個基本的認識，在實際的試驗過程中，關注藥物本身的特點，靈活的設計試驗，從而提供更多優質有效的信息，助力新藥的臨床研究。

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