萬邦(bang)醫藥分析測試中心(xin)在復雜基(ji)質樣本(ben)生物(wu)分析技術領域已經深耕了17年(nian)，具備了卓越的技術實力和豐富的實踐經驗，包括在低分子量肝素類領域已完成抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性分析方法的方法驗證。

分(fen)(fen)析(xi)(xi)測(ce)試中心擁有符合中美(mei)雙(shuang)報要求的(de)(de)大小分(fen)(fen)子生(sheng)物樣(yang)(yang)本(ben)檢測(ce)平臺，嚴格的(de)(de)質量管理(li)體系以及一(yi)套先進的(de)(de)生(sheng)物樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)(fen)析(xi)(xi)設備，能(neng)夠滿足各種(zhong)復雜的(de)(de)生(sheng)物樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)(fen)析(xi)(xi)需求；已經完(wan)成(cheng)了(le)超過500項的(de)(de)生(sheng)物樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)(fen)析(xi)(xi)實驗，檢測(ce)了(le)超過90萬(wan)支樣(yang)(yang)本(ben)。我們接受了(le)國家局的(de)(de)20多次核查，并成(cheng)功獲得了(le)40多次免核查的(de)(de)認可(ke)。專業高效(xiao)的(de)(de)生(sheng)物樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)(fen)析(xi)(xi)團隊，將為您提(ti)供(gong)藥(yao)代動力學(xue)生(sheng)物(wu)分(fen)析服務、免(mian)疫原性生(sheng)物(wu)分(fen)析服務、藥(yao)效(xiao)學(xue)和生(sheng)物(wu)標志物(wu)研究等(deng)服(fu)務，誠摯歡迎全國(guo)各地的朋友前來(lai)合作交流(liu)。

 低(di)分子(zi)肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）主要(yao)用(yong)(yong)(yong)于治(zhi)療急性(xing)(xing)靜脈血栓和(he)(he)急性(xing)(xing)冠脈綜合(he)癥(zheng)(心絞痛、心肌(ji)梗塞等(deng)(deng)(deng)(deng))，同時，在婦(fu)產(chan)(chan)科、生殖科等(deng)(deng)(deng)(deng)科室的抗(kang)(kang)凝血輔助治(zhi)療中的作用(yong)(yong)(yong)日益突(tu)顯。低(di)分子(zi)肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)因(yin)分子(zi)量小、副作用(yong)(yong)(yong)少、抗(kang)(kang)凝效(xiao)(xiao)果好，逐步成為(wei)臨床治(zhi)療的優選。隨著人(ren)(ren)口(kou)老齡(ling)化，心血管患病人(ren)(ren)數增加等(deng)(deng)(deng)(deng)原因(yin)，使得中國肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)類藥物(wu)(wu)(wu)市場前景(jing)廣(guang)闊。臨床上常用(yong)(yong)(yong)的低(di)分子(zi)量肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)（LMWH）產(chan)(chan)品(pin)有依(yi)諾肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)、達(da)肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)、那屈肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈣、帕肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)和(he)(he)汀肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)等(deng)(deng)(deng)(deng)。但因(yin)LMWH體內劑量與PK關(guan)系尚未闡明，且LMWH為(wei)成分復雜的混合(he)物(wu)(wu)(wu)，所以無法(fa)以藥代動(dong)力學(xue)為(wei)生物(wu)(wu)(wu)等(deng)(deng)(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)評價的終(zhong)點指標，需進行人(ren)(ren)體藥效(xiao)(xiao)學(xue)生物(wu)(wu)(wu)等(deng)(deng)(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)。同時，FDA 通過個藥指南（依(yi)諾肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)、達(da)肝(gan)(gan)(gan)(gan)素(su)鈉(na)）制(zhi)定LMWH仿制(zhi)產(chan)(chan)品(pin)的5 項評價標準(zhun)，其中第(di)5項為(wei)使用(yong)(yong)(yong)抗(kang)(kang)Xa 因(yin)子(zi)、抗(kang)(kang)Ⅱa 因(yin)子(zi)活性(xing)(xing)作為(wei)人(ren)(ren)體內PD終(zhong)點生物(wu)(wu)(wu)等(deng)(deng)(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)研(yan)究(jiu)的檢(jian)測(ce)指標。因(yin)此，生物(wu)(wu)(wu)樣本中抗(kang)(kang)Xa因(yin)子(zi)、抗(kang)(kang)Ⅱa因(yin)子(zi)活性(xing)(xing)是LMWH仿制(zhi)產(chan)(chan)品(pin)等(deng)(deng)(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)評價的重要(yao)依(yi)據。

抗(kang)(kang)Xa 因(yin)(yin)子(zi)(zi)、抗(kang)(kang)Ⅱa 因(yin)(yin)子(zi)(zi)活性的(de)生物分析方法(fa)一(yi)般使用(yong)二(er)步顯色法(fa)（2 Stages Heparin Assay），其原(yuan)理是(shi)抗(kang)(kang)凝(ning)血(xue)(xue)酶(mei)Ⅲ（AT-Ⅲ）與(yu)(yu)肝(gan)(gan)素(su)(su)結(jie)合后(hou)，對血(xue)(xue)漿(jiang)中凝(ning)血(xue)(xue)絲氨(an)酸蛋白酶(mei)（包括(kuo)Ⅱa因(yin)(yin)子(zi)(zi)、Xa因(yin)(yin)子(zi)(zi)）的(de)抑制作用(yong)會(hui)增加（也是(shi)肝(gan)(gan)素(su)(su)的(de)抗(kang)(kang)凝(ning)作用(yong)機制）。在AT-Ⅲ、凝(ning)血(xue)(xue)因(yin)(yin)子(zi)(zi)（Ⅱa或(huo)Xa）過量條件(jian)下，肝(gan)(gan)素(su)(su)與(yu)(yu)AT－Ⅲ結(jie)合后(hou)，再結(jie)合凝(ning)血(xue)(xue)因(yin)(yin)子(zi)(zi)，只(zhi)有未被結(jie)合的(de)凝(ning)血(xue)(xue)因(yin)(yin)子(zi)(zi)才能發揮水解活性，將顯色底(di)物（對硝基苯胺，pNA）從特(te)異性底(di)物中釋放出來。未被結(jie)合的(de)凝(ning)血(xue)(xue)因(yin)(yin)子(zi)(zi)與(yu)(yu)肝(gan)(gan)素(su)(su)濃度負相關(guan)，最終測定的(de)顯色底(di)物吸光值與(yu)(yu)肝(gan)(gan)素(su)(su)濃度呈(cheng)負相關(guan)。

在實踐中，該類產品的生物分析主要參照配體結合分析的相關要求，如9012《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，ICH M10 等。方法學驗證中主要考察項目包括準確度與精密度（包括批內考察、批間考察）、選擇性（健康人基質、溶血基質等）、平行性、定量范圍、稀釋線性和鉤狀效應、穩定性等。以下簡述六種方法驗證及樣本分析的主要關注點：

（一）該體(ti)系顯色(se)較快，須嚴(yan)格控制每步(bu)孵育時間及孵育溫度，在操作(zuo)時用計時器精確到秒，力(li)求優(you)異的實驗結果。

（二）穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)數(shu)據是方法(fa)穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)的(de)重要(yao)支柱，全面驗(yan)(yan)證標準品(pin)/受(shou)試(shi)制劑(ji)(ji)/參比(bi)制劑(ji)(ji)在各(ge)條件下(xia)的(de)穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)以證明待(dai)測(ce)物的(de)穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)及方法(fa)的(de)耐用性(xing)(xing)。其驗(yan)(yan)證項包括：①儲備液穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)；②全血穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)（不同(tong)溫(wen)度(du)）；③血漿(jiang)樣(yang)本穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)（凍融(rong)循環、不同(tong)溫(wen)度(du)）；④樣(yang)品(pin)前處理(li)過程中的(de)穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)；⑤處理(li)后樣(yang)品(pin)穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)（不同(tong)儲存條件）。因涉及到標準品(pin)、參比(bi)制劑(ji)(ji)與受(shou)試(shi)制劑(ji)(ji)，故穩(wen)(wen)(wen)(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)樣(yang)本是一(yi)般(ban)項目的(de)3倍，復雜且龐大，需要(yao)實驗(yan)(yan)人員邏(luo)輯清晰，步步謹慎(shen)。

（三）在以發色底物法測定抗Ⅱa/Xa活性中，生(sheng)物樣本不同(tong)(tong)程度的(de)溶血會對活性檢(jian)測有不同(tong)(tong)程度的(de)影響，使檢(jian)測結(jie)果出現偏差。因(yin)此，在方法學驗證時對血漿樣品不同(tong)(tong)程度的(de)溶血情況(kuang)進行考察，并拍照留檔為后期(qi)試驗提(ti)供(gong)數據(ju)支(zhi)持，為臨床機構(gou)和分(fen)析測試中心提(ti)供(gong)判(pan)斷(duan)標準。

（四）血(xue)樣(yang)的(de)采(cai)集與處理也可能會(hui)影響血(xue)漿中抗Xa因子、抗Ⅱa因子的(de)活(huo)性，因此(ci)，采(cai)血(xue)條(tiao)件(jian)、抗凝(ning)劑種(zhong)類及濃(nong)度(du)、采(cai)血(xue)后抗凝(ning)管(guan)的(de)混勻(yun)操(cao)作、允許的(de)離心(xin)前放置條(tiao)件(jian)（時間、溫度(du)） 、離心(xin)條(tiao)件(jian)（時間、溫度(du)、速度(du)） 均(jun)須進行提前規(gui)定(ding)，并且與分析方法驗(yan)證考察時使用(yong)的(de)條(tiao)件(jian)一致。

（五）因溶血、脂血、黃疸等樣本(ben)均可能干(gan)擾抗Xa活性的測定。我們從(cong)源(yuan)頭控制輕(qing)柔采血、細心處理樣本(ben)，盡(jin)量避免溶血。同時建立雙(shuang)方統一的溶血程(cheng)度判斷標(biao)準并記錄(lu)，在樣本(ben)交接時的溶血狀態確(que)認與記錄(lu)。

（六(liu)）肝(gan)素類產品(pin)的(de)生物樣(yang)品(pin)分析(xi)通常(chang)會使用(yong)微(wei)孔板(ban)(ban)，將每個(ge)板(ban)(ban)作為獨立的(de)分析(xi)批(pi)，使用(yong)獨立的(de)校準(zhun)曲線和質控樣(yang)品(pin)。同(tong)一(yi)(yi)例受試(shi)者的(de)全(quan)部樣(yang)品(pin)盡可能分布在同(tong)一(yi)(yi)分析(xi)批(pi)以減少結果(guo)的(de)變異，如果(guo)一(yi)(yi)塊分析(xi)板(ban)(ban)無法(fa)包括(kuo)全(quan)部樣(yang)品(pin)，分析(xi)計(ji)劃中應規定同(tong)一(yi)(yi)例受試(shi)者樣(yang)品(pin)在分析(xi)批(pi)間的(de)分布方案(an)。板(ban)(ban)位信息、讀板(ban)(ban)值等原始數據(ju)均應完整(zheng)(zheng)保存，并(bing)完整(zheng)(zheng)匯(hui)報。

目(mu)前FDA和EMA對等(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)(xing)(xing)評(ping)(ping)價指標有所差異，主(zhu)要集中在(zai)是否將抗Ⅱa 因子(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)作(zuo)為(wei)主(zhu)要等(deng)(deng)效(xiao)(xiao)依(yi)據(ju)以及(ji)對等(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)判斷(duan)標準。NMPA建議將抗Xa因子(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)作(zuo)為(wei)主(zhu)要PD等(deng)(deng)效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)(xing)(xing)評(ping)(ping)價依(yi)據(ju)、抗Ⅱa因子(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)作(zuo)為(wei)支(zhi)持性(xing)(xing)(xing)(xing)依(yi)據(ju)，但對分(fen)子(zi)(zi)鏈(lian)相對較長的(de)LMWH產品(pin)需要同樣(yang)考慮評(ping)(ping)價抗Ⅱa 因子(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。因此，在(zai)LMWH 生物樣(yang)本分(fen)析(xi)中，須同時檢(jian)測(ce)抗Xa 因子(zi)(zi)、抗Ⅱa 因子(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)，并在(zai)總(zong)結報告中匯(hui)報。

參(can)考文獻：

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